济宁速生法桐组织培养繁殖技术的要点和方法

1.济宁速生法桐组织培养实验室的生产设施
(1) 化学实验室。
培养植物材料和试管苗生产所使用器具的洗涤和灭菌,植物材料的预处理,都是在化学 实验室中进行的。
(2) 接种室。
接种室是植物材料接种的设施3接种要求在无菌环境下进行,无菌条件的好坏、持续时 间的长短对减轻植物材料的污染和提高接种工作效率关系重大。
(3) 培养室。
培养室是在人工环境条件下培养接种物和试管苗的场所.为满足培养材料生长、增殖 的需要,培养室必须具备人工调控温度、湿度、光照和通风的设备。
(4) 温室。
温室或大棚等保护设施是植物组织培养所必需的。生根培养后的济宁速生法桐幼苗必须经过在保护
设施内的过渡才能适应自然环境。
2.植物组织培养的仪器设备
(1) 天平。
配制培养基,需要不同精密度的天平称M药品。常用的有药物天平、分析天平和电子天 平等。
(2) 高压蒸汽灭菌锅。
灭菌锅用于培养基及器械的灭菌。常用的是手提式内热高压灭菌锅。
(3) 烘箱。
用于玻璃器皿的干燥或灭菌。
(4) 冰箱。
家用冰箱即可,用于药剂或植物材料的低温保存。
(5) 蒸馏水器3
植物组织培养常使用蒸馏水或去离子水,可以用蒸馏水器大批M制作备用。
(6) 空调机。
用于培养室环境温度的调控。
(7) 超净工作台。
超净工作台是利用风机将空气经过细菌过滤装置,输送至工作台面3
(8) 培养架3
用于培养容器的放置,由支架、隔板和灯具组成。
(9) 玻璃器皿。
培养器皿3培养植物材料和贮存药剂,应选用硬质玻璃容器。常用的有试管、三角 衹、培养皿等。
盛装器皿。配制培养基时盛装药剂所使用的烧杯、试剂容器等。
计M器皿:> 试剂的计量器具,有量筒、容量瓶、移液器等。
(10) 金属器械。
组织培养不但需要玻璃器皿,具体操作时还需要一些金属工具,如镊子、剪刀、解剖刀、 过滤器械及接种针等。这些器械可以与医用器械或微生物实验室所用的器械通用。
(11) 消毒剂。
70%酒精。用于操作人员的手及用具的消毒。
植物材料的表面消毒剂。常用的有次氯酸钠、次氯酸钙、漠水、升汞溶液等。
3.培养基及其配制
济宁速生法桐植物组织培养过程中,植物材料的生长、增殖除了受到外界环境条件的影响外,还与培 痒基的种类、成分密切相关。要成功完成某种植物的组织培养,必须根据所取植物材料的种 矣和部位,选择合适的培养基和培养环境。
(1)配制母液。
生产中,为减少工作M,常将药剂配成比培养基所需浓度高10?100倍的母液,待使用 3夺按比例稀释。以最常用的MS培养基为例,制成4种母液:大M元素母液、微蛍元素母液、
铁盐母液和生长调节物质母液。制备母液,可以配制成单一化合物的母液或混合物母液3 在配制大量元素的无机盐母液时,应使各种成分充分溶解,然后混合,以防止混合时产生沉 淀。配制微M元素的混合母液时,应注意药品的添加顺序,以免发生沉淀。铁盐母液必须单 独配制(表5-3)。
为避免药品中的杂质对培养物产生不良影响,应采用化学纯或分析纯级别的药品。称 量时,为避免失误,最好两人协作,一人称M,一人记录并标记。配制好的母液应贴好标签, 注明配制倍数、日期及配1L培养基时应取的M。母液的使用期不应超过一个月,最好在 2T冰箱内保存。
(2)配制培养基。
配制培养基前,应做好准备工作3各母液按顺序排好,各种玻璃器皿、M筒、烧杯、吸管、 玻璃棒、移液管等放在指定的位置。
制备培养基的步骤如下:
称取规定数量琼脂,加水在恒温水浴或电炉上加热,待其溶化后,加入蔗糖,溶解后 定容至最终容积的75%。
按顺序加入各种母液,定容至最终容积。用pH计或pH试纸测pH。
充分混合后,用〇• lniol/L的NaOH或HC1溶液调整pH。
配制好的培养基趁热分装3可以利用漏斗直接分装,也可使用虹吸式分注法或滴管 法。一般在培养容器内装1/4?1/3容积培养基为宜。分装后立即塞上塞子,进行灭菌3
灭菌时,压力为〇.8~ 1. lkg/an'ClT时保持15?20分钟即可。灭菌后,切断电
源,锅内压力示数接近〇时,打开放气阀排出剩余蒸气,再取出培养基。
4.植物组织培养的一般方法 (1)组织培养前的准备工作。
母本植株的栽培管理。植物材料的质量状况直接影响其大批M后代的品质和苗圃 的经济效益3为获得理想的植物材料,对母本植株应进行专门的栽培管理。
针对母本植株生长的环境,通过管理措施可降低植株携带的杂菌数量,促进植株的生 长。具体措施包括:尽M避免连作r栽种前,对栽培基质进行消毒灭菌;生长期中尽M使用 无机肥,以免有机肥引起材料污染;尽可能为母本植株提供适宜的环境条件,有条件的进行 保护地栽培以保证培养材料的健壮生长。
培养材料的选择3目前组织培养获得成功的植物,培养材料的来源几乎涵盖了植物 体的各个部位D但是,不同植物或者同种植物不同取材部位的再生能力不一样,应选择最易 培养增殖的部位。
取材部位:对大多数植物来说,茎尖是组织培养较为理想的部位,但是生产中常会受到 植株茎尖数M较少的限制。目前,茎段、叶片、根、花瓣、鳞茎等材料的培养应用也非常广泛。 选取培养材料时,一方面要考虑材料的来源是否有保证,能否进行大批fi繁殖;另一方面要 考虑培养过程中茎尖分化产生的愈伤组织是否会引起不良变异而丧失原品种的优良性状D 还要考虑取材部位的发育状况,幼年组织具有比老年组织更高的形态发生能力。
取材时间的选择:植物的生长随季节发生变化,生长状况不同,培养材料对于外界诱导 的反应也不一样。大多数植物应在生长开始的时期获取培养材料,生长末期或进入休眠期 的外植体对诱导反应较为迟钝。
材料的大小:许多植物的茎尖组织培养证明,材料越小,培养成功的概率越低。因此,不 宜将外植休切取得过小。外植休也不是越大越好,有实验表明,过大容易引起污染。一般要 求茎尖培养的材料应大于〇. 2?0. 3mm,叶片和花瓣应大于5mm2,茎段长度应大于0. 5mm,
工具、用品等的推备。切取植物材料用的工具有解剖刀、接种针、镊子、放大镜等,药
品有酒精、无菌水、漂白粉、升汞溶液等。无菌滤纸等用品要在培养前准备妥当。
(2) 材料的灭菌。
常用的消毒剂有漂白粉(次氯酸钙1%?10%的滤液)浸泡5?30分钟、次氯酸钠溶液 (0.5%?10% )浸泡5?30分钟、升汞溶液(0• 1% ~ 1% )浸泡2?10分钟、酒精(70% )浸泡 0. 2 ~2分钟、双氧水(3%?10%)浸泡5?15分钟等。
漂白粉应随配随用,妥善保存。70%的酒精较其他浓度的酒精有更强的杀菌力和穿透 力,但杀菌不彻底,一般不单独使用,常用做表面消毒。升汞溶液杀菌效果好,但有剧毒,且 消毒后不容易去除残余的汞,需要多次冲洗。
消毒前,一般先用自来水流水冲洗。自田间采回的较大的植物材料可先用洗衣粉进行 洗涤。消毒时,将植物材料浸入70%酒精浸泡数秒钟,进行表面杀菌,然后浸入消毒溶液, 处理规定时间。倒出消毒液,用无菌水冲洗3次后,带人超净工作台准备接种培养。
(3) 材料的接种。
接种室的消毒。接种前,应首先清洁地面,并使用70%的酒精喷雾以降低接种室内 的灰尘。打幵紫外灯照射20分钟左右,杀灭空气中的杂菌。工作台面用酒精或新洁尔灭溶 液清洗。工作人员的头发、衣服、手指都会带来许多杂菌,因此接种前工作人员应穿好工作 服,戴上帽子,剪除指甲,并彻底洗手。
材料的分离与接种。经消毒处理的植物材料按其所需大小,在解剖放大镜或肉眼直
接观察下即可进行分离3为防止污染的发生,通常在无菌滤纸上切取培养材料。刀和镊子 每次使用后,都应放入70%酒精中浸泡并灼烧,冷却后备用3
接种时,要求迅速、准确,尽量减少暴露在空气中的时间。接种时,先用左手拿培养容 器,右手轻轻取下封口纸。将容器以45°左右的角度倾斜靠近酒精灯火焰,在灯焰上灼烧口 部几秒钟时间后,用右手无名指和小指取下橡胶塞。在灯焰上旋转灼烧瓶口或试管口,用镊 子将切取好的材料送人培养容器。镊子使用后浸入消毒酒精中备用。当培养容器内已均匀 接种若干材料后,再在灯焰上灼烧口部几秒钟时间。塞好塞子,扎好封口纸,进行标记,注明 接种名称及日期。
(4)组织培养阶段。
初代培养。这一阶段的培养目的是形成愈伤组织、诱导不定芽发生和刺激侧芽生 长。通过调控生长素和细胞分裂素控制培养物的生长。
继代培养。外植体长出许多分生组织,分离转入新的培养基继续培养D周期性地重 复这一过程,能使外植体以5倍以上的速度扩增。
生根培养。刺激培养材料生根,使外植体逐渐增强自身光合作用和根系的吸收能 力,提高对外界环境的抵抗能力。本阶段应进行筛选,淘汰生长不良和感染病的试管苗。
移栽与炼苗。苗木最终要在大自然的环境下生长。当试管苗具备了完整的营养器 官,就要由试管内的生长状态转变到自然条件下的独立生活。这个转变:要适当的锻炼和 适应过程,即炼苗。炼苗过程需要在温室或大棚内进行,环境逐渐接近自然条件,有利于提高济宁速生法桐苗木的移栽成活率。
取出济宁速生法桐试管苗后,用水将琼脂冲洗干净,淘汰生长不良的部分幼苗。移出培养室的幼苗仍 需生长在20丈?25尤的环境下,应适当遮荫并每天喷雾增加环境湿度。
经过在保护设施内4?6周的培育,苗木逐渐适应了外界环境,可以移栽到生产圃地里 进行常规栽培。

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